J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC线粒体糖类

生命体白血病表现出强大而多样的叶绿体新陈代谢，似乎是由肠胃一个组织的高氧病态致使的。由于活病态氧(ROS)的转化是这种新陈代谢的副产物，因此须要要以NAD腺嘌呤二核糖葡萄糖(NADPH)的范例来下滑降解应激，以应对这种叶绿体活病态的增强。NAD单核糖转移激酶(NNT)可通过NADPH的转化来保持稳定叶绿体的抗降解技能，但其在非小线粒体白血病(NSCLC)中亦会的效用尚未明确。本研究课题推测NNT的隐含在白血病动物静态静态中亦会轻微增强了病灶的逐步形成和波及病态。另则有，进一步研究课题推测NNT缺少亦会造成了叶绿体功用障碍，这与降解应激的大量缩减无关，而是以铁硫线粒体的活病态下滑为标志。这些弱点与NADPH的正确病态和ROS的积攒有关，这声称NNT在减轻这些极其重要线粒体糖类的降解中亦会起着巨大效用。

测试设计

许多少用的白血病动物静态静态是透过C57BL6/J动物静态的饲养策略而组织起来。奇怪的是，这些动物静态可携带纯合则有显子7-11的框内缺少以及叶绿体中亦会Nnt特异性的错义基因型造成了非功用线粒体的隐含。因此，可以透过这种纯净缺少的等位基因(NntΔex7-11)来评价NNT对白血病时有发生的受到影响。

首先，用于Kras基因型(LSL-KrasG12D/+)引起的白血病静态来检查Nnt隐含对白血病时有发生的受到影响。可携带Cre重组激酶的腺病毒传染LSL-KrasG12D/+动物静态，可正向KrasG12D在肠胃上皮中亦会的隐含和肠胃腺癌的逐步形成。透过LSL-KrasG12D/+动物静态和C57BL6/J动物静态发情转化成Nnt+/+隐含动物静态或NntΔex7-11/Δex7-11隐含动物静态(绘出1A-1B)。该静态中亦会Nnt的隐含造成了Cre重组激酶其会病灶的负荷加快3个月(绘出1C-1D)。然后，透过Kras基因型与p53缺少同时隐含(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)组织起来白血病静态。Nnt的隐含没改变Cre正向的KP动物静态的死亡率(绘出1E)。奇怪的是，在这个静态中亦会，p53的缺少消除了Nnt隐含对白血病逐步形成的受到影响，并且无论Nnt隐含如何，测试最后都普遍存在轻微的病灶负荷(绘出1F)。白血病负荷百分比的量化在各有不同遗传动物静态之间没相似之处(绘出1G-1H)。

虽然各有不同遗传动物静态之间的病灶负荷没相似之处，但确实判读到静态中亦会病灶波及病态的相似之处。我们推测Nnt+/+动物静态中亦会51.3%的病灶为3级(腺癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11动物静态中亦会仅有36.5%和38.8%的病灶是高级(绘出1I)。Nnt+/+动物静态时有发生4级病灶的频率显着缩减，归功于病灶波及病态的巨大变化(绘出1J)。总之，这些资料声称Nnt有利于了白血病的时有发生和波及。

2 NNT的缺少可不到影响叶绿体中亦会硫氧还线粒体(TXN)的抗降解政治体制

为了进一步评估NNT对白血病免疫学的受到影响，首先评估shRNA冲击NNT线粒体的隐含，仅限于4个隐含NNT线粒体的NSCLC线粒政治体制 (A549, H1299，H2009和PC9)和不隐含NNT线粒体的H441线粒体(绘出2A)。冲击NNT线粒体隐含选项性NSCLC线粒体的选项性技能(绘出2B)。并且推测慢病毒传染4天内NNT的减至下滑了H2009和PC9线粒体的适应性(绘出2C)。此则有，H441线粒体的选项性可不NNT的受到影响。

不一定认为NNT有助于NADPH的转化成技能，从而保持稳定叶绿体线粒体抗降解系统保持稳定转化成完全(绘出2D)。冲击NNT下滑了H1299、H2009和PC9线粒体中亦会NADPH: NADP+的百分比 (绘出2E)。慢病毒传染4天内叶绿体中亦会H2O2显着缩减(绘出2F)，所以NNT对H2O2解热现实生活很极其重要。

为了考虑到这些叶绿体ROS的缩减是不是与叶绿体抗降解系统有关，于是透过Western blotting评估叶绿体中亦会过降解物线粒体3(PRDX3)的降解完全。H2O2通过PRDX3解热，即一对半胱氨酸二硫键正向PRDX3逐步形成二聚体，并且必须通过TXN转化成这些半胱氨酸二硫键才能转化成PRDX3的抗降解功用。PRDX3二聚体的积攒是PRDX3降解的标志，是叶绿体降解应激的特指标志物。

奥特里芬是一种TXN转化成激酶(TRXR)选项性剂，虽然奥特里芬的疗法亦会造成了PRDX3线粒体大量降解，但NNT的缺少并没缩减PRDX3的降解(绘出2G)。此则有，NNT的缺少也没下滑叶绿体TXN2或TRXR2的线粒体准确度。总之，这些结果声称NNT在NSCLC线粒体选项性技能上起着极其重要效用，但NNT活病态的剥夺并不亦会损伤叶绿体TXN抗降解系统，也不亦会引起轻微的降解应激。

3 NNT的缺少亦会损伤叶绿体的降解技能

鉴于NNT在IMM中亦会的定位及其受到影响膜上质子数量级和转化成技能，于是试绘出聚焦NNT对叶绿体降解新陈代谢是不是极其重要。首先，用于海马线粒体则有数量级统计分析仪同步进行叶绿体受压测试，评估NNT缺少对一般叶绿体降解功用的受到影响。结果推测NNT缺少线粒体的耗氧量(OCR) 随叶绿体选项性剂的依次传递而被减低(绘出3A)。在在的是，NNT缺少线粒体的最大肺部技能在不意味着非耦合肺部的情况显着下滑(绘出3B)。这提示叶绿体降解弱点与NNT对质子位移的受到影响无关。鉴于NNT缺少轻微受到影响肺部技能，于是检查NNT缺少的H441线粒体是不是比NNT隐含线粒体具有极为少的降解和极为强的催化反应技能。这说明这些线粒体在没NNT的情况似乎通过叶绿体NADPH来源而保持稳定叶绿体的功用。

叶绿体的降解新陈代谢意味着ETC的功用，ETC由介导真核细胞的Fe-S线粒体多肽组成。考虑到Fe-S线粒体多肽的乙酰现实生活须要要NADPH，于是研究课题NNT冲击后叶绿体肺部功用的下滑是不是与Fe-S线粒体系统性。叶绿体受压测试可以对肺部功用同步进行一般病态的统计分析，但不可以对单个ETC多肽所含同步进行评估。因此，所写同步进行了极为为专业的测试来统计分析Fe-S线粒体依赖的肺部系统性多肽(I, II, III)。结果推测，基于多肽I(葡萄糖和重氮)的摄取，在NNT冲击后多肽I-III的活病态显着下滑(绘出3C)。此则有，NNT弱点线粒体轻微下滑了硫磺酸的OCR，声称下滑了硫磺酸NAD(SDH)活病态和多肽II-III每秒(绘出3D)。造成了这一成因的极其重要原因是SDH在ETC和TCA气化中亦会扮演着双重角色。

除了通过ETC保持稳定光电子量则有，Fe-S线粒体还保持稳定对降解新陈代谢至关极其重要的其他线粒体激酶的功用。为了考虑到NNT是不是参予其他Fe-S线粒体的功用，所写评估了TCA气化中亦会Fe-S线粒体——顺乌头酸激酶(ACO2)的活病态。结果推测冲击NNT显着下滑了NSCLC线粒政治体制中亦会ACO2的活病态(绘出3E)。ACO2活病态的下滑似乎亦会摧毁TCA气化，进而减低驱动ETC每秒的转化成病态微粒的转化。为了补足非小线粒体白血病中亦会ACO2功用的统计分析，于是评价Nnt隐含对KP白血病中亦会ACO2活病态的受到影响。结果声称，Nnt+/+动物静态病灶中亦会Aco2活病态轻微较低NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11中亦会的，不足Nnt的病灶表现出平均的活病态(绘出3F)。

4 则有源病态NADPH在NNT缺少后保持稳定Fe-S线粒体功用

为了考虑到与冲击NNT系统性的叶绿体Fe-S线粒体功用的下滑是不是与NADPH:NADP+的下滑有关，我们试绘出备有一种叶绿体NADPH的则有源病态来源。为了起着作用这一目的，我们选项了酵母叶绿体中亦会NADH激激酶pos5p，它可以葡萄糖化NADH而转化成NADPH。虽然pos5p以前在细菌中亦会也有则有源隐含，但据我们知晓，pos5p还没被导入哺乳动物系统。为了检查我们是不是能够有效地在生命体NSCLC线粒体的叶绿体中亦会隐含pos5p线粒体，我们对酵母线粒体同步进行了修饰，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9线粒体的叶绿体中亦会成功隐含了HA-tag标记的pos5p线粒体(绘出4A)。选项这些线粒政治体制是为了评估pos5p整修和NNT缺少系统性的Fe-S线粒体弱点的技能，推测冲击NNT后对它们致使很严重的受到影响。

pos5p的隐含扭转了线粒体中亦会冲击NNT后引起的NADPH: NADP+百分比的减低(绘出4B)。这与隐含pos5p线粒体中亦会pos5p被冲击后肺部链多样活动的减低有关(绘出4C和4D)。此则有，pos5p的隐含完全扭转了NNT冲击后ACO2活病态的下滑(绘出4E)。总之，这些资料声称保持稳定NNT隐含缺少时NADPH的准确度可以保护NSCLC线粒体中亦会Fe-S线粒体的功用。

5 NNT的缺少不亦会摧毁Fe-S线粒体的乙酰

考虑到叶绿体则有源病态NADPH能够西移动NNT缺少系统性Fe-S线粒体的弱点，并且NADPH是高效保持稳定Fe-S线粒体乙酰的必备条件，因此我们接下来试绘出考虑到NNT活病态是不是保持稳定这一现实生活。Fe-S线粒体乙酰时有发生在一个由半胱氨酸含硫激酶(NFS1)和Fe-S支架线粒体(ISCU)组成的多线粒体多肽中亦会。多肽中亦会任何一种所含的缺少都亦会受到影响乙酰，并且也与叶绿体弱点系统性。因此，我们冲击NFS1或ISCU隐含来研究课题摧毁Fe-S线粒体乙酰后对肺部链和ACO2的受到影响。

在H2009线粒体中亦会，冲击NFS1后显着下滑葡萄糖/重氮化学反应和硫磺酸化学反应中亦会肺部链多肽I-III的活病态，而在PC9线粒体中亦会只有多肽II-III活病态被轻微下滑(绘出5A和5B)。另则有，两个线粒政治体制中亦会，在葡萄糖/重氮和硫磺酸的效用下，冲击ISCU隐含后显着西移动了OCR(绘出5A和5B)。并且冲击NFS1或ISCU后显着下滑了线粒政治体制中亦会ACO2活病态(绘出5C)。奇怪的是，NNT冲击后所引起的弱点与Fe-S线粒体乙酰所须要微粒致使的弱点是同等极其重要的(绘出5A-5C)。

为了证明Fe-S线粒体弱点对NSCLC线粒体的叶绿体新陈代谢有功用病态受到影响，我们对冲击NNT或ISCU线粒体同步进行基于液相反应物-高分辨质谱(LC-HRMS)的新陈代谢组学研究课题。 对这些线粒体TCA气化的新陈代谢物同步进行统计分析，结果显示大多数中亦会间产物的轻元素时有发生了显着巨大变化(绘出5D)。这些都声称了降解新陈代谢的摧残和Fe-S线粒体功用弱点的一致病态。具体地说就是冲击NNT和ISCU隐含后，葡萄糖、重氮和富马酸被消耗。NNT缺少线粒体中亦会的糖类准确度被剩余，但冲击ISCU线粒体中亦会并没此结果。另则有，冲击ISCU线粒体中亦会硫磺酸大量积攒，而在NNT缺少线粒体中亦会则不普遍存在此成因(绘出5D)。

除了Fe-S线粒体ACO2和SDH则有，TCA气化还意味着另一种叶绿体Fe-S线粒体——硫辛酸合成激酶(LIAS)的功用。LIAS对于硫辛酸的合成以及极其重要硫辛氧化物基团的等价都非常极其重要，硫辛氧化物基团由PDH (E2)和α-酯戊二酸NAD(二氢硫辛酰胺S-硫磺酰转移激酶，DLST)组成。LIAS对Fe-S线粒体乙酰的摧毁尤其敏感性，因为其Fe-S簇在催化现实生活中亦会被消耗掉，这就要求不断地同步进行线粒体绑定。事实上，冲击NFS1和ISCU隐含亦会大量减低PC9线粒体中亦会PDH-E2和DLST的脂化，然而冲击NNT对线粒体脂化无受到影响(绘出5E)。总的来说，这些资料声称，NNT引发激酶和新陈代谢弱点，它们的弱点与Fe-S线粒体乙酰的摧毁系统性，但NNT不似乎各种因素这一现实生活。这凸显出冲击NNT和ISCU后对TCA气化转化成在在但又各有不同的受到影响。

6 NNT的缺少摧毁胺基酸新陈代谢

除了消耗TCA气化中亦会间体则有，NNT弱点线粒体的LC-HRMS新陈代谢组学统计分析声称胺基酸新陈代谢失调。冲击NNT有利于长链三酸甘油酯酰基肉碱的大量积攒，而长链三酸甘油酯酰基肉碱是胺基酸β-降解的底物(绘出6A)。鉴于在NNT弱点线粒体中亦会普遍存在肺部系统弱点，我们推测这些酰基肉碱的缩减是由于胺基酸降解减低。我们推测在H1299和PC9线粒体中亦会OCR与棕榈氧化物的降解有关，冲击NNT后OCR下滑(绘出6B)。我们还判读到NNT弱点线粒体中亦会饱和胺基酸和不饱和胺基酸均大量积攒(绘出6C)。胺基酸合成须要要消耗大量NADPH，而且NNT冲击后NADPH的正确病态下滑，于是我们认为这些胺基酸准确度的缩减是由于则有源病态胺基酸过量的缩减。另则有，我们推测，NNT弱点线粒体增强了对荧光棕榈酸在在物的吸收技能(绘出6D)。为了评价NNT冲击后胺基酸的积攒是不是是一个潜在的不利因素，我们用于饱和胺基酸棕榈酸酯性刺激NNT弱点线粒体24小时，推测NNT冲击后使H1299和H2009线粒体对棕榈氧化物敏感性(绘出6E)。此则有，NNT冲击后显着提高了H1299和PC9线粒体对单一不饱和胺基酸油氧化物的敏感性病态(绘出6F)。鉴于则有源病态胺基酸补足的危害受到影响，我们预计线粒体则有脂质消耗将保护NNT的缺少。令人惊讶的是，培养基中亦会的脂质消耗加剧了NNT的减至(绘出6G)。极为极其重要的是，NNT冲击后线粒体则有脂质缺少亦会缩减NADPH的消耗(绘出6H)，这声称在不足则有源病态胺基酸的情况不得不合成胺基酸，使NNT弱点线粒体中亦会NADPH的正确病态下滑。总的来说，这些资料声称NNT似乎在调节胺基酸新陈代谢中亦会起极其重要效用，NSCLC线粒体的胺基酸新陈代谢紊乱似乎是一个可透过的弱点。

7 NNT缺少后叶绿体靶向过降解氢激酶(MitoCatalase)扭转Fe-S线粒体功用

Fe-S线粒体对分子氧和极为多危害微粒的降解非常敏感性。虽然我们没判读到叶绿体线粒体抗降解系统的降解完全时有发生巨大变化，但这并不排除NNT冲击后引发的叶绿体ROS所需将这些敏感性病态糖类降解。为了探究这种似乎病态，我们用于了叶绿体靶向的过降解氢激酶(MitoCatalase)来增强叶绿体的抗降解技能。我们成功地在H1299、H2009和PC9线粒体中亦会过隐含了MitoCatalase (绘出7A)。MitoCatalase的隐含也部分西移动了NNT冲击后系统性叶绿体中亦会H2O2的转化成(绘出7B)。这与NNT冲击后肺部链多样活动的减低相对应(绘出7C和7D)。另则有，MitoCatalase的隐含恢复NNT冲击后ACO2的活病态(绘出7E)。综上所述，这些资料声称，提高叶绿体解热H2O2的技能可以避免NNT冲击后Fe-S线粒体时有发生弱点，从而使NNT在避免Fe-S线粒体时有发生降解方面起着效用，但对Fe-S簇的乙酰无效用。

结论

总之，我们的研究课题声称，NNT对白血病免疫学具有极其重要意义，主要是通过调控Fe-S线粒体而有利于叶绿体新陈代谢。与以往评价NNT功用的研究课题各有不同，我们描述了NNT对NSCLC中亦会叶绿体降解转化成稳态的微妙受到影响。在NSCLC中亦会，NNT活病态似乎减轻了大量降解新陈代谢引起的降解应激化学反应。我们的推测进一步声称了叶绿体新陈代谢在白血病时有发生中亦会的必要病态，说明叶绿体功用的增强似乎是白血病疗法的一个极其重要各种因素。激酶TPH-1对肾保护起巨大效用，似乎作为疗法CKD的潜在疗法各种因素。

原始出处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.